Plasma bicarbonate has a pKa of 6.1, yet it is the most important extracellular buffer at pH 7.4. Which feature best explains its effectiveness?

CO₂ is exhaled or retained by the lungs and HCO₃⁻ adjusted by the kidneys, so the pair's ratio is regulated

Carbonic anhydrase in red cells shifts the pKa of carbonic acid up to 7.4, so the pair buffers at its own pKa

Bicarbonate binds H⁺ irreversibly, so its buffering does not depend on how close the pH is to the pKa

CO₂ is exhaled or retained by the lungs and HCO₃⁻ adjusted by the kidneys, so the pair's ratio is regulated

Its plasma concentration is so low that even a little added acid restores the ratio of the pair to 20:1

A protein of pI 5.2 is to be captured by ion-exchange chromatography from a lysate buffered at pH 7.5. Which matrix will bind it, and why?

DEAE-cellulose, because above its pI the protein carries a net negative charge

CM-cellulose, because above its pI the protein carries a net positive charge

DEAE-cellulose, because above its pI the protein carries a net negative charge

CM-cellulose, because its carboxymethyl groups are positively charged at pH 7.5

DEAE-cellulose, because its diethylaminoethyl groups are negatively charged at pH 7.5

On a calibrated gel-filtration column in native buffer, a purified enzyme elutes at the same volume as a 150 kDa globular standard. Reducing SDS-PAGE of the enzyme shows a single band at 50 kDa. Assuming the enzyme is globular, what is the most reasonable conclusion?

It is a trimer of polypeptide chains of about 50 kDa each

It is a single 150 kDa chain that SDS hydrolyses into three pieces

It is a dimer of 75 kDa chains that run faster in the SDS gel

It is a 50 kDa monomer that also binds two molecules of matrix

It is a trimer of polypeptide chains of about 50 kDa each

Two DNA samples have the same length and sequence, but one was made by cells grown on ¹⁵NH₄Cl and the other on ¹⁴NH₄Cl. Which method separates them?

Equilibrium (isopycnic) centrifugation in a CsCl gradient, which separates them by buoyant density

Rate-zonal centrifugation on a 5–20% sucrose gradient, which separates them by sedimentation coefficient

Agarose gel electrophoresis, which separates them by the charge carried on the phosphate backbone

Differential centrifugation at rising RCF, which pellets the heavier sample at the lower force

In SDS-PAGE, what is the main role of sodium dodecyl sulphate?

It unfolds the chains and coats them with negative charge in proportion to length, so mass sets their mobility

It reduces the disulphide bonds between cysteine residues, so that subunits held by S–S bridges separate on the gel

It cross-links the acrylamide chains into a mesh whose pore size is set by the detergent concentration

It unfolds the chains and coats them with negative charge in proportion to length, so mass sets their mobility

It holds every protein at its isoelectric point during the run, so that the proteins separate according to pI

Which of the following statements about electrophoretic methods are correct?

In isoelectric focusing, a protein stops migrating where the pH of the gradient equals its pI

In a standard 2-D gel, proteins are separated by pI in the first dimension and by mass in the second

Native PAGE separates proteins by polypeptide mass alone, because the gel pores sieve them

In isoelectric focusing, a protein stops migrating where the pH of the gradient equals its pI

Agarose gels resolve DNA strands differing by a single nucleotide better than polyacrylamide gels do

In a standard 2-D gel, proteins are separated by pI in the first dimension and by mass in the second

In an EMSA, a labelled 30-bp promoter probe gives a slower-migrating band when incubated with nuclear extract. Which further result shows that the binding is sequence-specific?

The shifted band is lost with a 100-fold excess of unlabelled wild-type probe but not with excess unlabelled probe whose site is mutated

The shifted band is lost with excess unlabelled probe whose site is mutated but not with a 100-fold excess of unlabelled wild-type probe

The shifted band is lost with a 100-fold excess of unlabelled wild-type probe but not with excess unlabelled probe whose site is mutated

The shifted band grows stronger as more nuclear extract is added, while the band of free probe grows weaker

The shifted band disappears when the nuclear extract is boiled for ten minutes before it is added to the probe

In a yeast two-hybrid screen, cells carrying the bait (protein X fused to the Gal4 DNA-binding domain) together with an empty activation-domain vector already grow on medium lacking histidine (HIS3 reporter). What does this mean for colonies obtained with library preys?

Their growth is not evidence of interaction, because the bait switches on the reporter by itself

Each growing colony carries a genuine partner of X, because the bait clearly reaches the nucleus

The HIS3 reporter is defective, so repeating the screen with a lacZ reporter will fix the problem

X must be a membrane protein, since membrane proteins give the strongest two-hybrid signals

Their growth is not evidence of interaction, because the bait switches on the reporter by itself

Which of the following statements about methods for studying macromolecular interactions are correct?

In ChIP, formaldehyde cross-linking in living cells captures protein–DNA contacts as they exist in vivo

In DNase I footprinting, the protein-binding site appears as a gap of missing or weakened bands in the cleavage ladder

In ChIP, formaldehyde cross-linking in living cells captures protein–DNA contacts as they exist in vivo

Co-immunoprecipitation of Y with an antibody to X proves that X and Y touch each other directly, with no protein bridging them

In DNase I footprinting, the protein-binding site appears as a gap of missing or weakened bands in the cleavage ladder

In a GST pull-down, the GST-tagged bait and its bound partners are captured on beads that carry Ni²⁺–NTA

When a ligand binds a protein that has a single tryptophan, the emission maximum (excitation at 295 nm) moves from 352 nm to 336 nm and the intensity rises. The most reasonable interpretation is that the tryptophan

has moved into a more nonpolar environment shielded from the solvent

has become more exposed to water, as happens when a protein unfolds

has moved into a more nonpolar environment shielded from the solvent

passes its excitation energy to the ligand by FRET, quenching itself

is now excited through tyrosine residues, which emit at shorter wavelengths

A plasmid DNA preparation gives A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.5. What does this most likely indicate?

Contamination with protein or phenol, which absorb strongly near 280 nm

Contamination with RNA, which pulls the ratio below that of pure DNA

Partial melting of the DNA, which lowers its absorbance at 260 nm

A pure sample, since about 1.5 is the expected ratio for duplex DNA

Contamination with protein or phenol, which absorb strongly near 280 nm

Which of the following statements about absorbance and fluorescence measurements are correct?

A solution with an absorbance of 2.0 transmits 1% of the incident light

With one-photon excitation, fluorescence is emitted at a longer wavelength than the exciting light

Doubling the path length at constant concentration doubles the transmittance of the solution

A solution with an absorbance of 2.0 transmits 1% of the incident light

With one-photon excitation, fluorescence is emitted at a longer wavelength than the exciting light

NAD⁺ absorbs at 340 nm about as strongly as NADH, so the two cannot be told apart at that wavelength

बफ़र, वर्णलेखन, अपकेंद्रण, वैद्युतकण-संचलन, अन्योन्यक्रिया-परख तथा स्पेक्ट्रमिकी

यह अध्याय XL1 जैव रसायन के खंड XL1.4 का उत्तर देता है, जो जीवन विज्ञान (XL) पेपर के पाँच वैकल्पिक खंडों में से एक है। शीर्षक “विश्लेषणात्मक तकनीकें” इस प्रकार है: “जैविक तंत्रों में pH-परिवर्तन के विरुद्ध बफ़रन, हेंडरसन–हैसलबाल्क समीकरण; आयन-विनिमय, आकार-अपवर्जन व बंधुता वर्णलेखन, पतली परत व काग़ज़ वर्णलेखन, अपकेंद्रण; वैद्युतकण-संचलन द्वारा जैवअणुओं का अभिलक्षणन; DNA–प्रोटीन व प्रोटीन–प्रोटीन अन्योन्यक्रियाओं के अध्ययन की विश्लेषणात्मक विधियाँ; लैम्बर्ट–बियर नियम, UV-दृश्य व प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रमिकी; अगली पीढ़ी का DNA अनुक्रमण, PCR व स्थल-निर्देशित उत्परिवर्तजनन। प्रतिरक्षी–प्रतिजन अन्योन्यक्रिया; प्रतिरक्षा तकनीकें: प्रतिरक्षा-विसरण, प्रतिरक्षा-वैद्युतकण-संचलन, RIA व ELISA, फ़्लो साइटोमेट्री; एकक्लोनी प्रतिरक्षी व उनके अनुप्रयोग।” यह पहला अध्याय स्पेक्ट्रमिकी तक की भौतिक विधियाँ लेता है: बफ़र, वर्णलेखन, अपकेंद्रण, वैद्युतकण-संचलन, अन्योन्यक्रिया-परख तथा अवशोषण व प्रतिदीप्ति; दूसरा अध्याय DNA व प्रतिरक्षा विधियाँ लेता है। संख्यात्मक प्रश्न बफ़र का pH व संघटन, रक्त का अम्ल–क्षार गणित, Rf, आपेक्षिक अपकेंद्री बल, FRET दक्षता तथा बियर–लैम्बर्ट से सांद्रता व एंज़ाइम सक्रियता हैं।

1. बफ़र व हेंडरसन–हैसलबाल्क समीकरण

बफ़र किसी दुर्बल अम्ल (HA) व उसके संयुग्मी क्षार (A⁻) का मिश्रण है जो pH-परिवर्तन का प्रतिरोध करता है: मिलाया गया H⁺ A⁻ ग्रहण कर लेता है और मिलाया गया OH⁻ HA। Ka = [H⁺][A⁻]/[HA] का लघुगणक लेने पर हेंडरसन–हैसलबाल्क समीकरण मिलता है: pH = pKa + log([A⁻]/[HA])। जब [A⁻] = [HA] हो तो pH = pKa, और यहीं बफ़र-क्षमता अधिकतम होती है; उपयोगी परास लगभग pKa ± 1 है, जहाँ अनुपात 1:10 से 10:1 के बीच रहता है। अनुपात pH तय करता है और कुल सांद्रता क्षमता, अतः आदर्श तनुकरण pH नहीं बदलता पर बफ़र को दुर्बल कर देता है।

हल किया उदाहरण (संघटन)। pH 7.20 के 0.10 M फ़ॉस्फ़ेट बफ़र हेतु, pKa₂ (H₂PO₄⁻/HPO₄²⁻) = 6.86 लेकर: log([HPO₄²⁻]/[H₂PO₄⁻]) = 0.34, अतः अनुपात 10^0.34 = 2.19 है। क्षार-अंश 2.19/3.19 = 0.686 है, जिससे 68.6 mM HPO₄²⁻ व 31.4 mM H₂PO₄⁻ मिलते हैं। यही तर्क तय करता है कि Tris क्षार में कितना HCl मिलाना है, क्योंकि HCl का प्रत्येक मोल Tris के एक मोल को TrisH⁺ में बदलता है।

शरीर के बफ़र। कोशिकाओं के भीतर फ़ॉस्फ़ेट (कोशिकीय आयनिक सामर्थ्य पर pKa₂ लगभग 6.9, तनु विलयन में 7.2) व प्रोटीन प्रमुख हैं; हिस्टिडीन का इमिडाज़ोल समूह हीमोग्लोबिन को रक्त का प्रमुख बफ़र बनाता है। प्लाज़्मा का मुख्य बफ़र बाइकार्बोनेट है: CO₂ + H₂O ⇌ H₂CO₃ ⇌ H⁺ + HCO₃⁻, जिसे चिकित्सा में pH = 6.1 + log([HCO₃⁻]/(0.03 × pCO₂)) के रूप में लिखते हैं, जहाँ pCO₂ mmHg में व सांद्रताएँ mM में हैं। सामान्य मान, 24 mM व 40 mmHg, अनुपात 24/1.2 = 20 व pH 7.40 देते हैं। 7.4 से 1.3 इकाई दूर का pKa दुर्बल बफ़र होना चाहिए, पर यह तंत्र खुला है: फेफड़े मिनटों में pCO₂ और वृक्क घंटों से दिनों में HCO₃⁻ तय करते हैं, अतः अनुपात स्वयं नियंत्रित रहता है।

विकार	प्राथमिक परिवर्तन	सामान्य कारण	प्रतिपूर्ति
उपापचयी अम्लरक्तता	HCO₃⁻ घटता है	मधुमेही कीटोअम्लरक्तता, लैक्टिक अम्लरक्तता, वृक्क-विफलता	अतिश्वसन pCO₂ घटाता है
उपापचयी क्षाररक्तता	HCO₃⁻ बढ़ता है	लंबी उल्टी (HCl की हानि)	अल्पश्वसन pCO₂ बढ़ाता है
श्वसनी अम्लरक्तता	pCO₂ बढ़ता है	अल्पश्वसन: फेफड़ों का रोग, दबा हुआ श्वसन	वृक्क HCO₃⁻ रोकते हैं
श्वसनी क्षाररक्तता	pCO₂ घटता है	अतिश्वसन: चिंता, अधिक ऊँचाई	वृक्क HCO₃⁻ उत्सर्जित करते हैं

⚠️ प्रयोगशाला बफ़र का चयन

ऐसा बफ़र चुनें जिसका pKa कार्य-pH से एक इकाई के भीतर हो। Tris (25 °C पर pKa लगभग 8.1) ताप-संवेदी है: ठंडा करने पर उसका pKa बढ़ता है, अतः कमरे के ताप पर बनाया Tris बफ़र शीत-कक्ष में अधिक क्षारीय होता है। MES, MOPS व HEPES जैसे गुड-बफ़र जीवविज्ञान के लिए बनाए गए: उदासीनता के निकट pKa, नगण्य धातु-बंधन व झिल्ली से कम पारगम्यता।

2. वर्णलेखन: आयन-विनिमय, आकार-अपवर्जन, बंधुता, काग़ज़ व TLC

प्रत्येक वर्णलेखन में अणु स्थिर प्रावस्था व गतिशील प्रावस्था के बीच बँटता है; वह स्थिर प्रावस्था से बँधा या उसके भीतर जितना अधिक समय बिताता है, उतना धीमा चलता है। विधियाँ इस बात में भिन्न हैं कि कौन-सा गुण यह बँटवारा तय करता है।

विधि	पृथक्करण का आधार	सामान्य आधात्री व निक्षालन
आयन-विनिमय	बफ़र-pH पर कुल आवेश	धनायन-विनिमयकों पर ऋणात्मक समूह (कार्बोक्सीमेथिल, CM; सल्फ़ोप्रोपिल, S); ऋणायन-विनिमयकों पर धनात्मक समूह (डाइएथिलऐमिनोएथिल, DEAE; चतुष्क अमोनियम, Q); बढ़ती लवण-प्रवणता या pH-परिवर्तन से निक्षालन
आकार-अपवर्जन (जेल निस्यंदन)	आकार व आकृति (हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या)	तिर्यक-बंधित डेक्सट्रान, ऐगरोज़ या पॉलिऐक्रिलैमाइड के सरंध्र मनके; पूरे समय एक ही बफ़र, सबसे बड़े अणु पहले
बंधुता	स्थिरीकृत लिगैंड से विशिष्ट बंधन	Ni²⁺–NTA पर His₆-टैग, इमिडाज़ोल से निक्षालन; ग्लूटाथायोन पर GST-टैग, मुक्त ग्लूटाथायोन से निक्षालन; प्रोटीन A या G पर IgG; लेक्टिन पर ग्लाइकोप्रोटीन; बंधित प्रतिरक्षी पर प्रतिजन
काग़ज़	सेलुलोज़ में बँधे जल व चलते विलायक के बीच वितरण	निनहाइड्रिन से अमीनो अम्ल दिखाए जाते हैं
पतली परत (TLC)	मुख्यतः सिलिका या ऐलुमिना पर अधिशोषण	तीव्र, अल्प नमूना; UV, आयोडीन या निनहाइड्रिन से पहचान

आयन-विनिमय। प्रोटीन अपने pI से नीचे धनात्मक व ऊपर ऋणात्मक होता है, अतः pH < pI पर वह धनायन-विनिमयक से और pH > pI पर ऋणायन-विनिमयक से बँधता है। लवण आवेशित समूहों के लिए प्रतिस्पर्धा कर उसे निक्षालित करता है: कम आवेशित प्रोटीन कम लवण पर, अधिक आवेशित बाद में निकलते हैं। आकार-अपवर्जन। छिद्रों के लिए बहुत बड़े अणु केवल मनकों के बीच चलते हैं और रिक्त आयतन V₀ पर निकलते हैं; सबसे छोटे हर छिद्र में घूमकर कुल आयतन Vt के निकट निकलते हैं। Kav = (Ve − V₀)/(Vt − V₀) का मान 0 व 1 के बीच है, और गोलाकार प्रोटीनों में Ve, log M के साथ रैखिक रूप से घटता है, अतः मानक अणु देशी द्रव्यमान देते हैं। इसे SDS-PAGE से मिले उपइकाई-द्रव्यमान से भाग देने पर उपइकाइयों की संख्या मिलती है; लंबा प्रोटीन जल्दी निकलता है और वास्तविक से बड़ा दिखता है। बंधुता वर्णलेखन एक विशिष्ट बंधन-युग्म का उपयोग करता है और एक ही चरण में प्रोटीन को बहुत अधिक शुद्ध कर सकता है।

काग़ज़ व TLC एक प्रतिधारण गुणांक बताते हैं, Rf = (धब्बे के केंद्र द्वारा तय दूरी)/(विलायक-अग्र द्वारा तय दूरी), दोनों मूल-रेखा से मापी जाती हैं। Rf का मान 0 व 1 के बीच है और विलायक, ताप व प्लेट पर निर्भर करता है, अतः अज्ञात नमूने मानकों के साथ चलाए जाते हैं। काग़ज़ पर कम ध्रुवीय गतिशील विलायक के साथ जलविरागी ल्यूसीन ध्रुवीय ऐस्पार्टेट से अधिक दूर (ऊँचा Rf) जाता है। मूल-रेखा से 3.5 cm पर धब्बा व 10.0 cm पर अग्र हो तो Rf = 0.35।

3. अपकेंद्रण: RCF, अवसादन गुणांक व प्रवणताएँ

कोणीय वेग ω से r त्रिज्या पर घूमता कण ω²r क्षेत्र अनुभव करता है, जिसे g के गुणज में लिखते हैं: RCF = ω²r/g = 1.118 × 10⁻⁵ × r × N², जहाँ r cm में व N rpm में है। 10,000 rpm व r = 10 cm पर RCF = 1.118 × 10⁻⁵ × 10 × 10⁸ ≈ 11,200 × g। चूँकि RCF, r पर निर्भर है, विधियाँ rpm में नहीं, × g में लिखी जाती हैं; दूसरी त्रिज्या वाले रोटर में वही प्रयोग दोहराने के लिए r·N² स्थिर रखें, अर्थात् N₂ = N₁√(r₁/r₂)।

अवसादन गुणांक s = v/(ω²r) प्रति इकाई क्षेत्र वेग है, जिसे स्वेडबर्ग (1 S = 10⁻¹³ s) में मापते हैं। यह द्रव्यमान के साथ और विलायक की तुलना में कण के घनत्व के साथ बढ़ता है, तथा घर्षण-गुणांक के साथ घटता है, अतः समान द्रव्यमान का लंबा अणु सघन अणु से धीमे बैठता है। इसीलिए s मान जुड़ते नहीं: 30S व 50S उपइकाइयाँ 70S राइबोसोम बनाती हैं, और 40S व 60S उपइकाइयाँ 80S।

विभेदी अपकेंद्रण समांगी मिश्रण को बढ़ते RCF पर घुमाकर पेलेट एकत्र करता है: लगभग 600–1,000 × g पर केंद्रक व अटूटी कोशिकाएँ, लगभग 10,000–20,000 × g पर माइटोकॉन्ड्रिया, लाइसोसोम व पेरॉक्सीसोम, और लगभग 100,000 × g पर माइक्रोसोम (अंतर्द्रव्यी जालिका व प्लाज़्मा झिल्ली के पुटिका) नीचे बैठते हैं; अंतिम अधिप्लव कोशिकाद्रव्य है। अंश अशुद्ध होते हैं और चिह्नक एंज़ाइमों से जाँचे जाते हैं, जैसे माइटोकॉन्ड्रिया हेतु सक्सिनेट डिहाइड्रोजिनेज़ व अंतर्द्रव्यी जालिका हेतु ग्लूकोज़-6-फ़ॉस्फ़ेटेज़।
दर-क्षेत्रीय अपकेंद्रण नमूने को पहले से बनी मंद प्रवणता, प्रायः 5–20% सुक्रोज़, पर परत के रूप में रखता है जो पट्टियों को स्थिर रखती है। कण s द्वारा तय गति से क्षेत्रों के रूप में चलते हैं और उनके तली तक पहुँचने से पहले प्रयोग रोका जाता है; इससे राइबोसोमी उपइकाइयाँ, पॉलीसोम व संकुल पृथक होते हैं।
समघनत्वी (साम्य) अपकेंद्रण CsCl जैसी पर्याप्त तीव्र प्रवणता लेता है जिसमें प्रत्येक कण वहाँ रुकता है जहाँ माध्यम का घनत्व उसके प्लवन घनत्व के बराबर हो, घूर्णन कितना भी लंबा चले। यह आकार नहीं, घनत्व से पृथक करता है: DNA को GC-अंश से या ¹⁵N बनाम ¹⁴N चिह्न से, जैसा 1958 के मेसेल्सन–स्टाल प्रयोग में हुआ जिसने अर्धसंरक्षी प्रतिकृतीयन दिखाया।

4. वैद्युतकण-संचलन: SDS-PAGE, देशी जेल, IEF, 2-D व ऐगरोज़

E क्षेत्र में आवेशित अणु v = qE/f वेग से चलता है, अतः उसकी गतिशीलता v/E = q/f आवेश के साथ बढ़ती व घर्षण-कर्षण के साथ घटती है; जेल इसमें आणविक छलनी जोड़ता है। पॉलिऐक्रिलैमाइड (बिस-ऐक्रिलैमाइड से तिर्यक-बंधित ऐक्रिलैमाइड, अमोनियम परसल्फ़ेट व TEMED से बहुलकित) में प्रोटीन व छोटे DNA हेतु छोटे, समायोज्य छिद्र होते हैं और यह एक न्यूक्लियोटाइड से भिन्न DNA रज्जुकों को अलग कर देता है; ऐगरोज़ में लगभग सौ क्षारकों से दसियों किलोक्षारकों तक के DNA व RNA हेतु बड़े छिद्र होते हैं।

विधि	पृथक्करण का आधार	मुख्य लक्षण	क्या बताती है
SDS-PAGE	पॉलीपेप्टाइड द्रव्यमान	SDS प्रति g प्रोटीन लगभग 1.4 g बँधता है, शृंखलाएँ खोलता है व उनका अपना आवेश ढक देता है; β-मर्कैप्टोएथेनॉल या DTT डाइसल्फ़ाइड तोड़ते हैं	उपइकाई द्रव्यमान (log M दूरी के साथ रैखिक), शुद्धता
देशी PAGE	आवेश, आकार व आकृति एक साथ	कोई विकृतिकारक नहीं; संकुल व सक्रियता बची रहती है; एंज़ाइम सक्रियता-अभिरंजन से दिखते हैं	ओलिगोमरी अवस्था, समएंज़ाइम जैसे लैक्टेट डिहाइड्रोजिनेज़ के पाँच रूप
समविभव फ़ोकसन (IEF)	pI	वाहक ऐम्फ़ोलाइट या स्थिरीकृत प्रवणता से pH-प्रवणता; प्रोटीन वहाँ रुकता है जहाँ उसका कुल आवेश शून्य हो	pI, आवेश-रूपांतर जैसे फ़ॉस्फ़ोरिलित रूप
2-D वैद्युतकण-संचलन	पहले pI, फिर द्रव्यमान	IEF पट्टी को SDS जेल के आर-पार रखा जाता है; धब्बे द्रव्यमान स्पेक्ट्रममिति से पहचाने जाते हैं	प्रोटिओम मानचित्र, रूपांतरित रूप
ऐगरोज़ जेल	न्यूक्लिक अम्ल की लंबाई	फ़ॉस्फ़ेट मेरुदंड प्रति इकाई लंबाई लगभग स्थिर आवेश देता है; एथिडियम ब्रोमाइड या SYBR अभिरंजक	लैडर से तुलना कर खंड-आकार, प्लाज़्मिड रूप, RNA की अखंडता

⚠️ SDS-PAGE के दो जाल

अपचित व अनपचित लेन की तुलना करें: IgG अपचायक के बिना लगभग 150 kDa पर चलता है पर उसके साथ 50 kDa भारी व 25 kDa हल्की शृंखलाओं के रूप में, जिससे डाइसल्फ़ाइड-बंधित उपइकाइयाँ उजागर होती हैं। और लेमली जेल असतत है: संकेंद्रण जेल (pH 6.8, बड़े छिद्र) में ग्लाइसीन लगभग अनावेशित रहकर क्लोराइड के पीछे चलता है और प्रोटीनों को एक पतली पट्टी में दबा देता है; विभेदन जेल (pH 8.8) में ग्लाइसीन ऋणायनी होकर प्रोटीनों से आगे निकल जाता है और छलनी-क्रिया शुरू होती है।

5. DNA–प्रोटीन व प्रोटीन–प्रोटीन अन्योन्यक्रियाओं की विधियाँ

बंधन का अध्ययन शुद्ध घटकों के साथ पात्रे (in vitro) होता है, जो बंधुता व सटीक स्थल देता है, या जीवे (in vivo), जो दिखाता है कि अन्योन्यक्रिया कोशिका में होती है। प्रत्येक विधि का एक विशिष्ट नियंत्रण है जिस पर परीक्षक प्रश्न पूछते हैं।

विधि	सिद्धांत व पठन	मुख्य नियंत्रण या सीमा
EMSA (जेल शिफ़्ट)	देशी जेल पर प्रोटीन सहित चिह्नित DNA प्रोब; बँधा प्रोब मुक्त प्रोब से धीमा चलता है	अचिह्नित विशिष्ट प्रोब की अधिकता शिफ़्ट हटा देती है, उत्परिवर्ती प्रोब नहीं; प्रोटीन का प्रतिरक्षी सुपरशिफ़्ट देता है
DNase I फ़ुटप्रिंटिंग	प्रोटीन सहित व रहित सिरा-चिह्नित DNA को हल्का काटा जाता है; बँधा क्षेत्र लैडर में रिक्ति के रूप में दिखता है	सटीक स्थल बताता है; हाइड्रॉक्सिल-मूलक फ़ुटप्रिंटिंग अधिक सूक्ष्म है
ChIP	फ़ॉर्मेल्डिहाइड जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन को DNA से तिर्यक-बंधित करता है; क्रोमैटिन तोड़ा जाता है, प्रोटीन का प्रतिरक्षी-अवक्षेपण होता है, बंध उलटे जाते हैं और DNA qPCR या अनुक्रमण (ChIP-seq) से पढ़ा जाता है	जीवे अधिग्रहण दिखाता है; विशिष्ट प्रतिरक्षी चाहिए
यीस्ट टू-हाइब्रिड	बेट DNA-बंधक डोमेन (जैसे Gal4 का) से, प्रे सक्रियण डोमेन से जुड़ा; बंधन एक सक्रियक पुनः बनाता है जो HIS3 या lacZ रिपोर्टर चालू करता है	यीस्ट केंद्रक में होना चाहिए; अकेले सक्रिय करने वाला बेट मिथ्या-धनात्मक देता है
सह-प्रतिरक्षी-अवक्षेपण	X का प्रतिरक्षी लाइसेट से X खींचता है; साथी Y वेस्टर्न ब्लॉट से पहचाना जाता है	अंतर्जात संकुल, पर संपर्क अप्रत्यक्ष हो सकता है
पुल-डाउन	टैग-युक्त बेट (जैसे ग्लूटाथायोन मनकों पर GST संलयन) साथियों को पकड़ता है	शुद्ध प्रोटीनों के साथ प्रत्यक्ष बंधन दिखाता है
पृष्ठ प्लाज़्मॉन अनुनाद (SPR)	स्वर्ण संवेदक-चिप पर लिगैंड; बँधा विश्लेष्य सतह का अपवर्तनांक बदलता है, जो बिना चिह्न के वास्तविक समय में पढ़ा जाता है	kon, koff व KD = koff/kon देता है
FRET	उत्तेजित दाता प्रतिदीप्तिधर बिना उत्सर्जन के निकट ग्राही को ऊर्जा देता है; E = 1/[1 + (r/R₀)⁶]	लगभग 1–10 nm तक कार्य करता है; जीवित कोशिकाओं में प्रयोज्य

हल किए उदाहरण। SPR: kon = 1 × 10⁵ M⁻¹ s⁻¹ व koff = 1 × 10⁻³ s⁻¹ से KD = 10⁻⁸ M = 10 nM। FRET: r = R₀ पर दक्षता 0.5 है; r = 0.5R₀ पर 1/(1 + 1/64) = 0.98। छठी घात FRET को एक तीक्ष्ण आणविक पैमाना बनाती है।

⚠️ परिणाम से उतना ही निकालें जितना वह सिद्ध करे

EMSA की खिसकी पट्टी पात्रे बंधन सिद्ध करती है, कोशिका में नियमन नहीं; ChIP संकेत अधिग्रहण सिद्ध करता है, कार्य नहीं; co-IP एक संकुल की सदस्यता दिखाता है, प्रत्यक्ष संपर्क नहीं; टू-हाइब्रिड का परिणाम दूसरी विधि से पुष्टि माँगता है।

6. लैम्बर्ट–बियर नियम, UV-दृश्य व प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रमिकी

I₀ तीव्रता का प्रकाश विलयन में प्रवेश कर I तीव्रता से निकलता है। पारगम्यता T = I/I₀ व अवशोषकता A = log(I₀/I) = −log T = εcl, जहाँ ε मोलर अवशोषण गुणांक (M⁻¹ cm⁻¹), c मोलर सांद्रता व l पथ-लंबाई (प्रायः 1 cm) है। A = 1 प्रकाश का 10% और A = 2 केवल 1% पार जाने देता है। स्वतंत्र अवशोषकों की अवशोषकताएँ जुड़ती हैं। नियम तनु विलयनों पर लागू होता है; उच्च अवशोषकता, प्रकीर्णन या भटके प्रकाश, अथवा अणुओं के संगुणन पर A बनाम c का आलेख मुड़ जाता है।

UV-दृश्य स्पेक्ट्रमिकी। प्रोटीन 280 nm पर मुख्यतः ट्रिप्टोफ़ैन व टाइरोसीन के कारण, और 230 nm से नीचे पेप्टाइड बंधों के कारण प्रबल अवशोषण करते हैं; न्यूक्लिक अम्ल अपने क्षारकों के कारण 260 nm पर अवशोषण करते हैं। परिपाटी: A₂₆₀ = 1.0 (1 cm) लगभग 50 µg mL⁻¹ द्विरज्जुकी DNA, 40 µg mL⁻¹ RNA व 33 µg mL⁻¹ एकरज्जुकी DNA के तुल्य है; शुद्ध DNA का A₂₆₀/A₂₈₀ लगभग 1.8 व शुद्ध RNA का लगभग 2.0 होता है, और कम अनुपात प्रोटीन या फ़ीनॉल का संकेत है। DNA के पिघलने पर A₂₆₀ बढ़ता है (अतिवर्णी प्रभाव), क्योंकि अलग हुए क्षारक अधिक अवशोषण करते हैं। NADH व NADPH 340 nm पर अवशोषण करते हैं (ε = 6220 M⁻¹ cm⁻¹) जबकि NAD⁺ व NADP⁺ नहीं, अतः डिहाइड्रोजिनेज़, और युग्मित परखों द्वारा अन्य एंज़ाइम, 340 nm पर मापे जाते हैं।

हल किया उदाहरण। 1 में 20 तनुकृत DNA का A₂₆₀ = 0.40 हो तो सांद्रता 0.40 × 50 × 20 = 400 µg mL⁻¹ है। एंज़ाइम परख में A₃₄₀ का प्रति मिनट 0.0622 घटना (1 cm) बताता है कि NADH 0.0622/6220 = 1.0 × 10⁻⁵ M min⁻¹, अर्थात् 10 µM min⁻¹ की दर से खर्च हो रहा है; µmol min⁻¹ (इकाई) हेतु अभिक्रिया-आयतन से गुणा करें और विशिष्ट सक्रियता हेतु प्रोटीन-द्रव्यमान से भाग दें।

प्रतिदीप्ति। उत्तेजित अणु कंपन-विश्रांति से कुछ ऊर्जा खोकर नैनोसेकंडों में अधिक तरंगदैर्ध्य का फ़ोटॉन उत्सर्जित करता है (स्टोक्स विस्थापन); क्वांटम लब्धि प्रति अवशोषित फ़ोटॉन उत्सर्जित फ़ोटॉन है। अँधेरी पृष्ठभूमि के विरुद्ध मापे जाने से प्रतिदीप्ति अवशोषण से कहीं अधिक संवेदी है, पर यह केवल कम अवशोषकता पर रैखिक है और मानक वक्र माँगती है। ट्रिप्टोफ़ैन मुख्य आंतरिक प्रतिदीप्तिधर है: 295 nm पर उत्तेजित (टाइरोसीन से बचने हेतु) वह जल में लगभग 350 nm पर, पर अध्रुवीय क्रोड में दबे होने पर कम तरंगदैर्ध्य (नील विस्थापन) पर उत्सर्जन करता है, अतः वलन व लिगैंड-बंधन देखे जा सकते हैं। शमनकारी, बाह्य रंजक, GFP जैसे प्रतिदीप्त प्रोटीन और FRET इस विधि का विस्तार करते हैं।

मुख्य बिंदु

pH = pKa + log([A⁻]/[HA]): क्षमता pH = pKa पर अधिकतम व pKa ± 1 तक उपयोगी है; अनुपात pH तय करता है, कुल सांद्रता क्षमता। रक्त का pH = 6.1 + log([HCO₃⁻]/(0.03 pCO₂)); 24 mM बटा 1.2 mM से 7.40 मिलता है, और फेफड़े व वृक्क दोनों पदों का नियमन करते हैं।
आयन-विनिमय कुल आवेश से पृथक करता है (pI से नीचे प्रोटीन धनायन-विनिमयक से, ऊपर ऋणायन-विनिमयक से बँधता है); जेल निस्यंदन सबसे बड़े अणु पहले निकालता है और log M से देशी द्रव्यमान देता है; बंधुता विशिष्ट लिगैंड लेती है; Rf मूल-रेखा से मापा जाता है।
RCF = 1.118 × 10⁻⁵ r N² (r cm में, N rpm में); s स्वेडबर्ग में है और जुड़ता नहीं। विभेदी अपकेंद्रण पेलेट एकत्र करता है, दर-क्षेत्रीय s से पृथक कर जल्दी रोका जाता है, समघनत्वी साम्य पर प्लवन घनत्व से पृथक करता है।
SDS-PAGE उपइकाई द्रव्यमान देता है, देशी PAGE संकुल व सक्रियता बचाता है, IEF pI से पृथक करता है, 2-D जेल पहले pI फिर द्रव्यमान से, ऐगरोज़ DNA को लंबाई से पृथक करता है।
EMSA, फ़ुटप्रिंटिंग व ChIP DNA–प्रोटीन बंधन जाँचते हैं; टू-हाइब्रिड, co-IP, पुल-डाउन, SPR (KD = koff/kon) व FRET (1–10 nm पर दूरी का छठी-घात नियम) प्रोटीन–प्रोटीन बंधन, प्रत्येक अपने नियंत्रण के साथ।
A = εcl; प्रोटीन 280 nm पर, न्यूक्लिक अम्ल 260 nm पर (A₂₆₀ 1.0 ≈ 50 µg mL⁻¹ dsDNA), NADH 340 nm पर (ε 6220 M⁻¹ cm⁻¹)। प्रतिदीप्ति अधिक तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जित होती है, अधिक संवेदी है, और ट्रिप्टोफ़ैन का नील विस्थापन अधिक अध्रुवीय परिवेश बताता है।

अभ्यास प्रश्न (18)

उत्तर खोलने से पहले प्रत्येक प्रश्न हल करें। हर व्याख्या सही विकल्प के साथ लुभावना गलत विकल्प भी बताती है, क्योंकि अंक वहीं जाते हैं।

प्लाज़्मा बाइकार्बोनेट का pKa 6.1 है, फिर भी pH 7.4 पर वह सबसे महत्त्वपूर्ण बाह्यकोशिकीय बफ़र है। उसकी प्रभावशीलता को कौन-सा लक्षण सबसे अच्छी तरह समझाता है?
1. लाल कोशिकाओं का कार्बोनिक ऐनहाइड्रेज़ कार्बोनिक अम्ल का pKa 7.4 तक खिसका देता है, अतः युग्म अपने ही pKa पर बफ़रन करता है
2. बाइकार्बोनेट H⁺ को अनुत्क्रमणीय रूप से बाँधता है, अतः उसका बफ़रन इस पर निर्भर नहीं कि pH, pKa के कितना निकट है
3. फेफड़े CO₂ को बाहर निकालते या रोकते हैं और वृक्क HCO₃⁻ का समायोजन करते हैं, अतः युग्म का अनुपात नियंत्रित रहता है
4. प्लाज़्मा में उसकी सांद्रता इतनी कम है कि थोड़ा-सा अम्ल मिलाने पर ही युग्म का अनुपात फिर 20:1 हो जाता है
उत्तर देखें
उत्तर: C — फेफड़े CO₂ को बाहर निकालते या रोकते हैं और वृक्क HCO₃⁻ का समायोजन करते हैं, अतः युग्म का अनुपात नियंत्रित रहता है
बंद बफ़र-युग्म अपने pKa पर सर्वोत्तम कार्य करता है, और 7.4, 6.1 से 1.3 इकाई दूर है। बाइकार्बोनेट इसलिए सफल है कि वह खुला तंत्र है: घुला CO₂ श्वसन से और HCO₃⁻ वृक्कीय पुनरवशोषण व उत्सर्जन से तय होता है, अतः अनुपात के दोनों पद नियंत्रित हैं। कार्बोनिक ऐनहाइड्रेज़ भ्रामक विकल्प है, पर एंज़ाइम केवल CO₂ ⇌ H₂CO₃ अंतररूपांतरण तेज़ करता है, साम्य स्थिरांक या pKa नहीं बदल सकता। H⁺ का बंधन उत्क्रमणीय है, और कम सांद्रता बफ़रन को दुर्बल करेगी, उसे समझाएगी नहीं।
मधुमेही कीटोअम्लरक्तता के एक रोगी के धमनी रक्त में [HCO₃⁻] = 12 mM व pCO₂ = 25 mmHg है। pH = 6.1 + log([HCO₃⁻]/(0.03 × pCO₂)) का उपयोग कर, जहाँ 0.03 mM mmHg⁻¹ CO₂ की विलेयता है, रक्त का pH (दो दशमलव स्थानों तक) ____ है।
संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।
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उत्तर: 7.30
घुला CO₂ = 0.03 × 25 = 0.75 mM। अनुपात = 12/0.75 = 16, और log 16 = 1.204। pH = 6.1 + 1.204 = 7.30। कम HCO₃⁻ प्राथमिक उपापचयी अम्लरक्तता है; कम pCO₂ (सामान्य 40 mmHg) अतिश्वसन द्वारा श्वसनी प्रतिपूर्ति है। इसके बिना pCO₂ = 40 mmHg पर pH = 6.1 + log(12/1.2) = 7.10 होता।
Tris बफ़र बनाने हेतु 0.100 mol Tris क्षार जल में घोला जाता है और 1 L तक आयतन पूरा करने से पहले 1.00 M HCl मिलाया जाता है। TrisH⁺ का pKa 8.06 लेकर, यह मानकर कि HCl का प्रत्येक मोल Tris के एक मोल को TrisH⁺ में बदलता है, तथा सक्रियता-प्रभाव की उपेक्षा कर, pH 7.80 हेतु आवश्यक HCl का आयतन (mL में, एक दशमलव स्थान तक) ____ है।
संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।
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उत्तर: 64.5
log([Tris]/[TrisH⁺]) = 7.80 − 8.06 = −0.26, अतः क्षार:अम्ल = 10^−0.26 = 0.550। प्रोटॉनित अंश = 1/(1 + 0.550) = 0.645, अतः 0.645 × 0.100 mol = 0.0645 mol HCl, अर्थात् 1.00 M HCl का 64.5 mL। क्षार-अंश (0.355, जिससे 35.5 mL) लेना प्रचलित भूल है: लक्ष्य pH, pKa से नीचे है, अतः आधे से अधिक Tris प्रोटॉनित होना चाहिए।
pI 5.2 वाले एक प्रोटीन को pH 7.5 पर बफ़रित लाइसेट से आयन-विनिमय वर्णलेखन द्वारा पकड़ना है। कौन-सी आधात्री उसे बाँधेगी, और क्यों?
1. CM-सेलुलोज़, क्योंकि अपने pI से ऊपर प्रोटीन पर कुल धनात्मक आवेश होता है
2. DEAE-सेलुलोज़, क्योंकि अपने pI से ऊपर प्रोटीन पर कुल ऋणात्मक आवेश होता है
3. CM-सेलुलोज़, क्योंकि pH 7.5 पर उसके कार्बोक्सीमेथिल समूह धनावेशित होते हैं
4. DEAE-सेलुलोज़, क्योंकि pH 7.5 पर उसके डाइएथिलऐमिनोएथिल समूह ऋणावेशित होते हैं
उत्तर देखें
उत्तर: B — DEAE-सेलुलोज़, क्योंकि अपने pI से ऊपर प्रोटीन पर कुल ऋणात्मक आवेश होता है
अपने pI से ऊपर प्रोटीन कुल ऋणात्मक होता है। DEAE (डाइएथिलऐमिनोएथिल) समूह प्रोटॉनित व धनात्मक होते हैं, अतः DEAE-सेलुलोज़ ऋणायन-विनिमयक है और प्रोटीन को बाँधता है। CM (कार्बोक्सीमेथिल) समूह ऋणात्मक होते हैं, जिससे CM-सेलुलोज़ धनायन-विनिमयक है जो इस प्रोटीन को केवल pH 5.2 से नीचे बाँधेगा। भ्रामक विकल्प चिह्न-नियम उलट देता है: प्रोटीन अपने pI से नीचे धनात्मक होते हैं, ऊपर नहीं।
देशी बफ़र में अंशांकित जेल-निस्यंदन स्तंभ पर एक शुद्ध एंज़ाइम उसी आयतन पर निकलता है जिस पर 150 kDa का गोलाकार मानक। एंज़ाइम का अपचायी SDS-PAGE 50 kDa पर एक ही पट्टी दिखाता है। एंज़ाइम को गोलाकार मानते हुए सबसे तर्कसंगत निष्कर्ष क्या है?
1. यह 150 kDa की एक शृंखला है जिसे SDS तीन टुकड़ों में जल-अपघटित करता है
2. यह 75 kDa शृंखलाओं का डाइमर है जो SDS जेल में तेज़ चलती हैं
3. यह 50 kDa का मोनोमर है जो आधात्री के दो अणुओं से भी बँधता है
4. यह लगभग 50 kDa की तीन पॉलीपेप्टाइड शृंखलाओं का ट्राइमर है
उत्तर देखें
उत्तर: D — यह लगभग 50 kDa की तीन पॉलीपेप्टाइड शृंखलाओं का ट्राइमर है
देशी बफ़र में जेल निस्यंदन पूरे संयोजन का द्रव्यमान (150 kDa) बताता है, जबकि अपचायी SDS-PAGE प्रत्येक पृथक पॉलीपेप्टाइड का द्रव्यमान (50 kDa); 150/50 = 3 उपइकाइयाँ। SDS प्रोटीन को विकृत कर ढकता है पर पेप्टाइड बंध नहीं तोड़ता, अतः एक शृंखला तीन पट्टियाँ नहीं बन सकती। 75 kDa की शृंखला 75 kDa पर चलेगी, और आधात्री से चिपकने वाला प्रोटीन देर से निकलकर छोटा दिखता है, बड़ा नहीं।
एक TLC प्लेट पर मूल-रेखा निचले किनारे से 1.5 cm ऊपर खींची गई है। विकास के बाद विलायक-अग्र निचले किनारे से 13.5 cm और एक अमीनो अम्ल के धब्बे का केंद्र 6.3 cm ऊपर है। अमीनो अम्ल का Rf (दो दशमलव स्थानों तक) ____ है।
संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।
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उत्तर: 0.40
दोनों दूरियाँ प्लेट के किनारे से नहीं, मूल-रेखा से मापी जाती हैं: धब्बा = 6.3 − 1.5 = 4.8 cm, अग्र = 13.5 − 1.5 = 12.0 cm, अतः Rf = 4.8/12.0 = 0.40। किनारे से मापने पर 6.3/13.5 = 0.47 मिलता है, जो प्रचलित भूल है।
एक विधि 7.2 cm प्रभावी त्रिज्या वाले रोटर में 12,000 rpm पर माइटोकॉन्ड्रिया का पेलेट बनाती है। वही आपेक्षिक अपकेंद्री बल (RCF, r × N² के समानुपाती, N rpm में) 5.0 cm त्रिज्या वाले रोटर में पाना है। आवश्यक गति, rpm में निकटतम पूर्णांक तक, ____ है।
संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।
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उत्तर: 14400
समान RCF का अर्थ r₁N₁² = r₂N₂² है, अतः N₂ = N₁√(r₁/r₂) = 12,000 × √(7.2/5.0) = 12,000 × √1.44 = 12,000 × 1.2 = 14,400 rpm। दोनों प्रयोग लगभग 1.118 × 10⁻⁵ × 7.2 × 12,000² ≈ 11,600 × g देते हैं। छोटी त्रिज्या को अधिक गति चाहिए; N को r के सीधे अनुपात में बदलना (17,280 rpm) भूल जाता है कि N का वर्ग होता है।
दो DNA नमूनों की लंबाई व अनुक्रम समान हैं, पर एक ¹⁵NH₄Cl पर और दूसरा ¹⁴NH₄Cl पर उगाई कोशिकाओं से बना है। कौन-सी विधि उन्हें पृथक करती है?
1. CsCl प्रवणता में साम्य (समघनत्वी) अपकेंद्रण, जो उन्हें प्लवन घनत्व से पृथक करता है
2. 5–20% सुक्रोज़ प्रवणता पर दर-क्षेत्रीय अपकेंद्रण, जो उन्हें अवसादन गुणांक से पृथक करता है
3. ऐगरोज़ जेल वैद्युतकण-संचलन, जो उन्हें फ़ॉस्फ़ेट मेरुदंड पर स्थित आवेश से पृथक करता है
4. बढ़ते RCF पर विभेदी अपकेंद्रण, जो भारी नमूने को कम बल पर पेलेट कर देता है
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उत्तर: A — CsCl प्रवणता में साम्य (समघनत्वी) अपकेंद्रण, जो उन्हें प्लवन घनत्व से पृथक करता है
¹⁵N लंबाई या आवेश बदले बिना DNA को थोड़ा अधिक घना बनाता है। CsCl प्रवणता में प्रत्येक अणु वहाँ रुकता है जहाँ माध्यम का घनत्व उसके अपने घनत्व के बराबर हो, अतः भारी, हल्का व संकर DNA अलग पट्टियाँ बनाते हैं, जो मेसेल्सन–स्टाल प्रयोग का आधार है। सुक्रोज़ दर-क्षेत्रीय प्रयोग में द्रव्यमान का सूक्ष्म अंतर s को नगण्य बदलता है; ऐगरोज़ लंबाई से पृथक करता है, जो यहाँ समान है; विभेदी अपकेंद्रण इतना छोटा अंतर नहीं पकड़ सकता।
SDS-PAGE में सोडियम डोडेसिल सल्फ़ेट की मुख्य भूमिका क्या है?
1. यह सिस्टीन अवशेषों के बीच डाइसल्फ़ाइड बंधों को अपचित करता है, जिससे S–S सेतुओं से जुड़ी उपइकाइयाँ जेल पर अलग हो जाती हैं
2. यह ऐक्रिलैमाइड शृंखलाओं को ऐसे जाल में तिर्यक-बंधित करता है जिसके छिद्र-आकार को अपमार्जक की सांद्रता तय करती है
3. यह पॉलीपेप्टाइडों को खोलकर उनकी लंबाई के अनुपात में ऋणावेश से ढकता है, अतः गतिशीलता मुख्यतः द्रव्यमान पर निर्भर होती है
4. यह प्रयोग के दौरान हर प्रोटीन को उसके समविभव बिंदु पर रखता है, जिससे प्रोटीन pI के अनुसार पृथक होते हैं
उत्तर देखें
उत्तर: C — यह पॉलीपेप्टाइडों को खोलकर उनकी लंबाई के अनुपात में ऋणावेश से ढकता है, अतः गतिशीलता मुख्यतः द्रव्यमान पर निर्भर होती है
SDS प्रति g प्रोटीन लगभग 1.4 g बँधकर शृंखला खोलता है और उसका अपना आवेश ढक देता है, जिससे आवेश-द्रव्यमान अनुपात लगभग स्थिर हो जाता है और जेल द्रव्यमान से छानता है। डाइसल्फ़ाइड तोड़ना β-मर्कैप्टोएथेनॉल या DTT का कार्य है, SDS का नहीं; यही भ्रामक विकल्प है। तिर्यक-बंधक बिस-ऐक्रिलैमाइड है, और pI से पृथक्करण समविभव फ़ोकसन है।
वैद्युतकण-संचलन विधियों के बारे में निम्नलिखित में से कौन-से कथन सही हैं?
1. देशी PAGE प्रोटीनों को केवल पॉलीपेप्टाइड द्रव्यमान से पृथक करता है, क्योंकि जेल के छिद्र उन्हें छानते हैं
2. समविभव फ़ोकसन में प्रोटीन वहाँ रुक जाता है जहाँ प्रवणता का pH उसके pI के बराबर हो
3. ऐगरोज़ जेल एक न्यूक्लियोटाइड से भिन्न DNA रज्जुकों को पॉलिऐक्रिलैमाइड जेल से बेहतर अलग करते हैं
4. मानक 2-D जेल में प्रोटीन पहली विमा में pI से और दूसरी में द्रव्यमान से पृथक होते हैं
उत्तर देखें
उत्तर: B — समविभव फ़ोकसन में प्रोटीन वहाँ रुक जाता है जहाँ प्रवणता का pH उसके pI के बराबर हो; D — मानक 2-D जेल में प्रोटीन पहली विमा में pI से और दूसरी में द्रव्यमान से पृथक होते हैं
अपने pI पर प्रोटीन का कुल आवेश शून्य होता है और वह pH-प्रवणता में रुक जाता है, तथा मानक 2-D जेल में पहले IEF व फिर SDS-PAGE चलता है। देशी PAGE वाला कथन गलत है, क्योंकि SDS के बिना गतिशीलता आवेश, आकार व आकृति तीनों पर निर्भर है। ऐगरोज़ वाला कथन गलत है, क्योंकि उसके छिद्र एक-न्यूक्लियोटाइड विभेदन हेतु बहुत बड़े हैं; इसके लिए अनुक्रमण जेलों जैसा विकृतिकारी पॉलिऐक्रिलैमाइड चाहिए।
एक EMSA में 30-bp का चिह्नित प्रमोटर प्रोब केंद्रकीय निष्कर्ष के साथ ऊष्मायन पर धीमी चलने वाली पट्टी देता है। कौन-सा अगला परिणाम दिखाता है कि बंधन अनुक्रम-विशिष्ट है?
1. खिसकी पट्टी उत्परिवर्तित स्थल वाले अचिह्नित प्रोब की अधिकता से लुप्त होती है पर अचिह्नित वन्य-प्रकार प्रोब की 100 गुना अधिकता से नहीं
2. खिसकी पट्टी अचिह्नित वन्य-प्रकार प्रोब की 100 गुना अधिकता से लुप्त होती है पर उत्परिवर्तित स्थल वाले अचिह्नित प्रोब की अधिकता से नहीं
3. अधिक केंद्रकीय निष्कर्ष मिलाने पर खिसकी पट्टी प्रबल होती जाती है, जबकि मुक्त प्रोब की पट्टी दुर्बल होती जाती है
4. प्रोब में मिलाने से पहले केंद्रकीय निष्कर्ष को दस मिनट उबालने पर खिसकी पट्टी गायब हो जाती है
उत्तर देखें
उत्तर: B — खिसकी पट्टी अचिह्नित वन्य-प्रकार प्रोब की 100 गुना अधिकता से लुप्त होती है पर उत्परिवर्तित स्थल वाले अचिह्नित प्रोब की अधिकता से नहीं
विशिष्ट बंधन उसी अनुक्रम की अधिकता से प्रतिस्पर्धित होता है पर उत्परिवर्तित स्थल वाले अनुक्रम से नहीं, क्योंकि प्रोटीन उत्परिवर्ती से दुर्बलता से बँधता है। मात्रा-निर्भरता व उबालने पर लोप केवल यह दिखाते हैं कि कोई ताप-अस्थिर प्रोटीन प्रोब से बँधता है, जो अविशिष्ट DNA-बंधक प्रोटीन भी करेगा। उलटा प्रतिस्पर्धा-प्रतिरूप यह बताएगा कि प्रोटीन प्रमोटर-स्थल के बजाय उत्परिवर्ती को पसंद करता है।
एक यीस्ट टू-हाइब्रिड स्क्रीन में बेट (Gal4 DNA-बंधक डोमेन से जुड़ा प्रोटीन X) व रिक्त सक्रियण-डोमेन वेक्टर वाली कोशिकाएँ हिस्टिडीन-रहित माध्यम (HIS3 रिपोर्टर) पर पहले से ही उगती हैं। लाइब्रेरी के प्रे के साथ मिली कॉलोनियों के लिए इसका क्या अर्थ है?
1. हर उगती कॉलोनी में X का वास्तविक साथी है, क्योंकि बेट स्पष्टतः केंद्रक तक पहुँचता है
2. HIS3 रिपोर्टर दोषपूर्ण है, अतः lacZ रिपोर्टर के साथ स्क्रीन दोहराने से समस्या हल हो जाएगी
3. X अवश्य झिल्ली प्रोटीन है, क्योंकि झिल्ली प्रोटीन सबसे प्रबल टू-हाइब्रिड संकेत देते हैं
4. उनकी वृद्धि अन्योन्यक्रिया का प्रमाण नहीं है, क्योंकि बेट स्वयं ही रिपोर्टर चालू कर देता है
उत्तर देखें
उत्तर: D — उनकी वृद्धि अन्योन्यक्रिया का प्रमाण नहीं है, क्योंकि बेट स्वयं ही रिपोर्टर चालू कर देता है
रिपोर्टर तभी चालू होना चाहिए जब बेट–प्रे बंधन सक्रियण डोमेन को प्रमोटर तक लाए। यदि रिक्त AD वेक्टर सहित बेट ही HIS3 सक्रिय कर दे, तो X में अपनी ट्रांसऐक्टिवेशन क्षमता (स्वसक्रियण) है और किसी भी प्रे के साथ वृद्धि की व्याख्या नहीं हो सकती; सामान्य उपाय X का वह खंड है जिसमें यह क्षमता न हो, या अधिक कठोर रिपोर्टर। रिपोर्टर ठीक कार्य कर रहा है, दोषपूर्ण नहीं, अतः lacZ रिपोर्टर भी चालू होगा; और झिल्ली प्रोटीन दुर्बल बेट होते हैं क्योंकि परख को केंद्रक-प्रवेश चाहिए।
वृहदणुओं की अन्योन्यक्रियाओं के अध्ययन की विधियों के बारे में निम्नलिखित में से कौन-से कथन सही हैं?
1. ChIP में जीवित कोशिकाओं में फ़ॉर्मेल्डिहाइड तिर्यक-बंधन प्रोटीन–DNA संपर्कों को वैसे ही पकड़ता है जैसे वे जीवे होते हैं
2. X के प्रतिरक्षी से Y का सह-अवक्षेपण सिद्ध करता है कि X व Y बिना किसी मध्यस्थ प्रोटीन के एक-दूसरे को सीधे स्पर्श करते हैं
3. DNase I फ़ुटप्रिंटिंग में प्रोटीन-बंधन स्थल विदलन-लैडर में लुप्त या दुर्बल पट्टियों की रिक्ति के रूप में दिखता है
4. GST पुल-डाउन में GST-टैग वाला बेट व उससे बँधे साथी Ni²⁺–NTA वाले मनकों पर पकड़े जाते हैं
उत्तर देखें
उत्तर: A — ChIP में जीवित कोशिकाओं में फ़ॉर्मेल्डिहाइड तिर्यक-बंधन प्रोटीन–DNA संपर्कों को वैसे ही पकड़ता है जैसे वे जीवे होते हैं; C — DNase I फ़ुटप्रिंटिंग में प्रोटीन-बंधन स्थल विदलन-लैडर में लुप्त या दुर्बल पट्टियों की रिक्ति के रूप में दिखता है
ChIP लयन से पहले कोशिकाओं के भीतर ही संपर्क स्थिर कर देता है, और फ़ुटप्रिंटिंग में बँधा प्रोटीन अपने स्थल को DNase I से बचाता है, जिससे लैडर में रिक्ति बनती है। co-IP केवल यह दिखाता है कि X व Y एक संकुल में हैं; कोई तीसरा प्रोटीन उन्हें जोड़ सकता है। GST ग्लूटाथायोन से बँधता है, Ni²⁺–NTA से नहीं, जो His-टैग वाले प्रोटीन पकड़ता है।
एक दाता–ग्राही युग्म की फ़ॉर्स्टर दूरी R₀ = 5.0 nm है। एक संरूपण-परिवर्तन दोनों रंजकों के बीच की दूरी 5.0 nm से 7.5 nm कर देता है। E = 1/[1 + (r/R₀)⁶] का उपयोग करने पर FRET दक्षता 0.50 से बदलकर हो जाती है
1. लगभग 0.08
2. लगभग 0.33
3. लगभग 0.31
4. लगभग 0.23
उत्तर देखें
उत्तर: A — लगभग 0.08
r/R₀ = 7.5/5.0 = 1.5 और 1.5⁶ = 11.4, अतः E = 1/(1 + 11.4) = 0.081। छठी घात की तीव्र निर्भरता ही कारण है कि FRET कुछ नैनोमीटर के परिवर्तन इतनी तीक्ष्णता से बताता है। 0.33 यह मानता है कि E दूरी के अनुपात में घटती है, तथा 0.31 व 0.23 छठी के बजाय दूसरी व तीसरी घात लेते हैं।
लैक्टेट डिहाइड्रोजिनेज़ की परख 340 nm पर NADH ऑक्सीकरण देखकर (ε = 6220 M⁻¹ cm⁻¹, पथ-लंबाई 1.0 cm) 3.0 mL अभिक्रिया में की जाती है जिसमें 0.020 mg एंज़ाइम प्रोटीन है। A₃₄₀ प्रति मिनट 0.124 घटता है। विशिष्ट सक्रियता, µmol min⁻¹ mg⁻¹ में दो दशमलव स्थानों तक, ____ है।
संख्यात्मक उत्तर — मान टाइप करें।
उत्तर देखें
उत्तर: 2.99
सांद्रता-परिवर्तन की दर = ΔA/(εl) = 0.124/6220 = 1.994 × 10⁻⁵ M min⁻¹ = 19.94 µM min⁻¹। 3.0 mL में यह 19.94 µmol L⁻¹ min⁻¹ × 0.0030 L = 0.0598 µmol min⁻¹ है। 0.020 mg से भाग देने पर 2.99 µmol min⁻¹ mg⁻¹, अर्थात् प्रति mg 2.99 इकाई। 3.0 mL आयतन भूल जाना प्रचलित भूल है।
जब कोई लिगैंड एकमात्र ट्रिप्टोफ़ैन वाले प्रोटीन से बँधता है, तो उत्सर्जन-अधिकतम (295 nm पर उत्तेजन) 352 nm से 336 nm पर आ जाता है और तीव्रता बढ़ जाती है। सबसे तर्कसंगत व्याख्या यह है कि ट्रिप्टोफ़ैन
1. जल के प्रति अधिक अनावृत हो गया है, जैसा प्रोटीन के खुलने पर होता है
2. विलायक से बचे अधिक अध्रुवीय परिवेश में चला गया है
3. FRET द्वारा अपनी उत्तेजन-ऊर्जा लिगैंड को देकर स्वयं शमित हो रहा है
4. अब टाइरोसीन अवशेषों के माध्यम से उत्तेजित होता है, जो कम तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जन करते हैं
उत्तर देखें
उत्तर: B — विलायक से बचे अधिक अध्रुवीय परिवेश में चला गया है
ट्रिप्टोफ़ैन का उत्सर्जन उसके परिवेश पर निर्भर है: जल के संपर्क में वह लगभग 350–355 nm पर, और अध्रुवीय कोटर में दबे होने पर कम तरंगदैर्ध्य (नील विस्थापन) पर, प्रायः अधिक क्वांटम लब्धि के साथ, उत्सर्जन करता है। प्रोटीन का खुलना इसका उलटा, लाल विस्थापन, देता है। लिगैंड को ऊर्जा-स्थानांतरण तीव्रता घटाएगा, बढ़ाएगा नहीं, और 295 nm पर उत्तेजन ठीक इसीलिए चुना जाता है कि टाइरोसीन उत्तेजित न हो।
एक प्लाज़्मिड DNA निर्मिति का A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.5 है। यह सबसे संभवतः क्या दर्शाता है?
1. RNA का संदूषण, जो अनुपात को शुद्ध DNA से नीचे खींच लेता है
2. DNA का आंशिक पिघलना, जो 260 nm पर उसकी अवशोषकता घटा देता है
3. शुद्ध नमूना, क्योंकि द्विरज्जुकी DNA हेतु अपेक्षित अनुपात लगभग 1.5 है
4. प्रोटीन या फ़ीनॉल का संदूषण, जो 280 nm के निकट प्रबल अवशोषण करते हैं
उत्तर देखें
उत्तर: D — प्रोटीन या फ़ीनॉल का संदूषण, जो 280 nm के निकट प्रबल अवशोषण करते हैं
शुद्ध DNA लगभग 1.8 व शुद्ध RNA लगभग 2.0 देता है, अतः 1.5 का अनुपात बताता है कि 280 nm के निकट अवशोषण करने वाला कुछ उपस्थित है, प्रायः प्रोटीन (ऐरोमैटिक अवशेष) या बचा हुआ फ़ीनॉल। RNA अनुपात बढ़ाएगा, और पिघलना A₂₆₀ बढ़ाता है (अतिवर्णी प्रभाव), जिससे भी अनुपात बढ़ेगा।
अवशोषकता व प्रतिदीप्ति मापन के बारे में निम्नलिखित में से कौन-से कथन सही हैं?
1. स्थिर सांद्रता पर पथ-लंबाई दोगुनी करने से विलयन की पारगम्यता दोगुनी हो जाती है
2. 2.0 अवशोषकता वाला विलयन आपतित प्रकाश का 1% पार जाने देता है
3. एक-फ़ोटॉन उत्तेजन में प्रतिदीप्ति उत्तेजक प्रकाश से अधिक तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जित होती है
4. NAD⁺ 340 nm पर लगभग NADH जितना ही अवशोषण करता है, अतः उस तरंगदैर्ध्य पर दोनों में भेद नहीं हो सकता
उत्तर देखें
उत्तर: B — 2.0 अवशोषकता वाला विलयन आपतित प्रकाश का 1% पार जाने देता है; C — एक-फ़ोटॉन उत्तेजन में प्रतिदीप्ति उत्तेजक प्रकाश से अधिक तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जित होती है
A = −log T, अतः A = 2.0 से T = 10⁻² = 1%; और उत्सर्जन से पहले कंपन-विश्रांति एक-फ़ोटॉन प्रतिदीप्ति को अधिक तरंगदैर्ध्य की ओर खिसकाती है (स्टोक्स विस्थापन)। पथ दोगुना करने से अवशोषकता दोगुनी होती है, जो पारगम्यता को दोगुना नहीं बल्कि उसका वर्ग कर देती है (जैसे 0.5 से 0.25)। 340 nm पर केवल अपचित रूप NADH व NADPH अवशोषण करते हैं; इसी अंतर के कारण डिहाइड्रोजिनेज़ परखें वहीं पढ़ी जाती हैं।